假如你看到文章标题激光捕捉显微镜切割这八个字,脑子里想到了什么?
激光,从街头小贩的激光笔到技术工程师手中的激光测距仪,从救死扶伤的激光手术到科幻大片中的激光武器装备……好像并没什么新奇,但激光捕获又是什么呢?
切割用水果刀切橡皮擦到长大,用水果刀切卷心菜,从伐木工用钢锯切木材到焊工切金属材料……人们似乎对切割并不陌生,但显微镜切割是什么呢?
激光捕获 显微切割=???
Part 1 显微镜切割
显微切割(microdissection)在显微镜或光学显微镜下,根据显微镜计算机操作系统,从组织、细胞组、细胞组、细胞、细胞成分或性染色切割或细胞玻片中选择的原材料,进行切割和分离,收集后续分析的技术。
实际上早在1912年,Tschachotin对焦光在分子生物学和医学中逐渐用于微操作,称为 Strahlenstich1962年,Bessis激光**与光学显微镜结合,利用紫外线或红外激光束切割组织,大大减少了显微镜切割对当地细胞周围组织的损伤。
Part 2 激光捕获显微镜切割
1996中国癌症研究室病理生理学实验室Michael R. Emmert-Buck国家卫生研究院Robert F. Bonner其他人明确提出了激光捕获显微镜切割的技术(Laser capture microdissection)。基本操作流程如下:
1、根据倒置显微镜测角仪中的机械泵,将准备好的组织切成片固定。
2、根据标本采集选择倒置显微镜,调整光学显微镜,准确定位整体目标区域。
3、将含有EVA膜(丁二烯乙烯酸乙烯酯膜)的收集帽放置在当地组织或细胞中,使用低动能近红外光谱仪激光直接进入底部,使EVA膜变软引起粘附力,粘附整体目标组织或细胞EVA然后在膜上与周围组织或细胞分离。
4、将切割的组织或细胞迁移到加入提取物的离心管架中DNA、RNA或蛋白质,用以下分析。
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技术概述:
激光捕获显微镜切割是一种技术工具,在显微镜下从组织切割到片中分离和净化单个细胞群或单个细胞。它具有快速、简单、准确、非特异性强的优点,已成为科学研究组织或细胞非特异表达和分子结构系统的主要专用工具。
基本概念:
显微镜切割用激光捕获(LCM)它是根据一束低红外激光单脉冲激话热塑料薄膜,可以选择性地将整个目标细胞或组织碎片粘在薄膜上。热塑料薄膜是丁二烯乙酸乙烯酯薄膜,其厚度约为100~200 μm,大的消化吸收峰接近红外激光波长,可以消化吸收激光引起的大部分动能,瞬间将激光束直射区域的温度提高到90°C,然后维持数ms快速冷却后,确保分子伴侣不受损坏。低动能红外激光通常用于试验,以防止损伤性光化学反应。
LCM系统软件包括倒置显微镜、固体红外激光二极管、激光控制设备、光学显微镜测角仪操作手柄、电莲藕相机、液晶显示器等。LCM中用以捕获总体目标细胞的热塑封膜直径通常为6 mm,它通常覆盖在完全透明的塑料帽上,正好与后续试验中常用的规格 相匹配0.5 ml离心管架一致。
机械臂悬架可操作覆盖热塑料薄膜的塑料帽,存放在干燥组织切片的整体目标位置,在光学显微镜下选择整体目标细胞。它发送的激光单脉冲可以立即加热 EVA膜部分融化EVA膜渗透到切片上*小的组织间隙中,在几乎ms内部快速凝结。当组织和膜之间的粘结力超过其与盖玻片之间的粘结力时,可以完成整个目标细胞可选择性迁移的过程。激光单脉冲通常是连续的0.5~5.0ms,它可以在所有塑料帽的表面反复进行,然后迅速分离出许多整体目标细胞。塑料帽盖在配有缓冲溶液的离心管架上,将选定的细胞迁移到离心管架上,并根据分离出感兴趣的分子结构来完成后期试验。
论文参考文献:
Michael R. Emmert-Buck,Robert F. Bonner,Paul D. Smith,et al. Laser Capture Microdissection. Science,1996,274(5289): 998-1001.
S. Thalhammer,J. Geigl,A. Zink,et al. AFM and Laser Microdissection as Tools for Life Sciences. Acta Microscopica,2003,12(sup A) :1-4.